今天给同学们分享一篇生信文章“Network Pharmacology and Bioinformatics Study of Geniposide Regulating Oxidative Stress in Colorectal Cancer”，这篇文章发表在Int J Mol Sci期刊上，影响因子为5.6。

结果解读：

作者分别通过Swiss Target Prediction、TargetNet、CTD（Comparative Toxicogenomics Database）和TCMSP数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database）检索到了102、473、24和7个与栀子苷相关的靶点。在合并和去重四个数据库的相关靶点后，总共获得了548个与栀子苷相关的靶点。随后，作者使用Cytoscape软件构建了栀子苷及其相关靶点的网络图，如图2所示。

为了确定与CRC相关的关键基因模块，作者使用WGCNA算法在健康人群和CRC患者中建立了共表达网络和模块。作者计算了GSE44076中每个基因的表达方差，然后选择了方差最显著的前25%的基因进行进一步分析。当软功率值设置为10，尺度自由R2等于0.9时，作者确定了共表达基因模块，如图3A所示。使用动态切割算法，在拓扑交集矩阵（TOM）的热图中获得了总共九个不同颜色的共表达模块，如图3B-D所示。随后，将这九个颜色模块中的基因依次应用于分析模块与临床特征（正常组和CRC组）的共表达的相似性和邻接性。此外，绿色模块与CRC之间显示出最显著的关系，其中包括5157个基因，如图3E所示。最后，作者观察到不同CRC样本中绿色模块基因之间存在正相关关系，如图3F所示。

为了探索栀子苷调节氧化应激对结直肠癌的作用，作者将栀子苷的靶点与CRC中最关键的模块基因和与氧化应激相关的基因进行交叉，得到了共计34个关键基因，如图4所示，包括DNMT1、HSP90AA1、PTPN1、ESR1、PTK2、RELA、CDK4、CDK5、ADRB1、MAPKAPK2、TRPV1、CDK2、NOS3、JAK2、MIF、GSK3B、ACHE、MMP3、NR3C1、HSP90AB1、ADRB3、MMP1、BCL2、ELANE、HDAC2、RAC1、PRKCB、BCL2L1、GAPDH、HSPA8、HSPA5、CHEK1、FOXO1、IL1B。然后，作者使用Cytoscape软件构建了一个化合物-疾病-靶点网络图，如图5所示。

作者将上述34个关键基因导入String数据库，得到了关键基因之间的蛋白质相互作用网络，如图6所示。

通过R语言软件的“聚类分析器”包，对调节氧化应激的34个关键基因的栀子苷抗结直肠癌的GO功能富集分析进行了研究。共获得1582个GO条目（p值<0.05），主要包括生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF），如表1所示。其中，BP条目有1395个，主要涉及对温度刺激的反应、对生物碱和一氧化氮的生物合成过程等。CC条目有61个，主要与黑素体、色素颗粒、富含ficolin-1的颗粒等相关。此外，MF条目有126个，主要与组蛋白激酶活性、泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合等相关。以上分析表明，栀子苷可能作用于这些细胞结构，影响这些生物过程，并通过调节氧化应激发挥这些分子功能，以达到抗结直肠癌的目的，如图7所示。

通过利用R语言软件的“聚类分析器”包，对34个基于丹参苷的关键基因在CRC上进行了KEGG通路富集分析。结果显示，丹参苷干预CRC的信号通路有87条（p值<0.05），主要涉及癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、p53信号通路、NF-κB信号通路和NOD样受体信号通路，如图8所示。

最后，作者将复合物-疾病-治疗靶点-核心通路网络文件导入Cytoscape软件，绘制了通路网络图，更直观地展示了中药治疗CRC的活性成分的多组分-多靶点作用特征，如图9所示。

如图10所示，作者筛选了34个关键基因，并发现当度值大于平均值时，选择了18个基因（IL1B，GSK3B，NOS3，RELA，CDK4，HSP90AB1，NR3C1，FOXO1，JAK2，CDK2，HSPA8，CDK5，HSPA5，CHEK1，HDAC2，PTK2，DNMT1，PTPN1）。如图10B-C所示，根据度值，所有前五个基因（IL1B，GSK3B，NOS3，RELA和CDK4）均大于15，被选为后续分析的关键基因。GO和KEGG的功能富集分析表明，栀子苷调节氧化应激抗结直肠癌的机制可能与细胞焦痂死有关，而氧化应激是细胞焦痂死的重要诱导方法之一。为了探索关键基因与焦痂死基因之间的相关性，作者进行了关键基因与焦痂死热点基因（IL1A，IL1B，IL18，GZMB，GZMA，GSDMB，CYCS，CHMP2B，CASP5，BAK1）的相关性分析。结果显示，IL1B，CDK4和RELA与焦痂死热点基因密切相关，如图11所示。

作者利用starBase、miRDB数据库和miRnada数据库构建了一个基于关键基因的ceRNA网络。该网络包括319个节点（5个关键基因、157个miRNA和157个lncRNA）（图12）。具体而言，共有119个lncRNA能够与miRNA hsa-miR-4318、hsa-miR-3147和hsa-miR-29a-5p竞争性结合，以调控GSK3B。在ceRNA网络中，有11个lncRNA能够与miRNA hsa-miR-495-3p、hsa-miR-326和hsa-miR-4303结合，以调控关键基因IL1B。miRNA hsa-miR-4318、hsa-miR-4280、hsa-miR-103b、hsa-miR-506-3p、hsa-miR-198、hsa-miR-568、hsa-miR-149-3p和hsa-miR-486-5p结合以调控关键基因CDK4。miRNA hsa-miR-4318、hsa-miR-4254、hsa-miR-761、hsa-miR-4297、hsa-miR-3202、hsa-miR-1303、hsa-miR-4324和hsa-miR-214-3p结合以调控关键基因NOS3。此外，还有18个lncRNA能够与hsa-miR-156-5p、hsa-miR-858-3p和hsa-miR-7-5p结合，以调控关键基因RELA。

为了理解关键基因之间的相互关系，作者对它们进行了蛋白相互作用网络分析，如图13所示。随后，作者在GEPIA数据库中进行了差异表达水平、病理分期和生存期的分析。结果显示，CRC组中关键基因的表达显著高于正常组，p值小于0.05，如图14A所示。此外，IL1B高表达组的预后具有统计学意义，如图14B所示。病理分期显示，随着疾病进展，IL1B的mRNA水平逐渐降低，而NOS3的mRNA水平逐渐增加，如图14C所示。HPA数据库的结果显示，除了IL1B没有相应的数据外，其他关键基因在结直肠癌组织中以不同程度表达（图15）。

通过CYBERSORT分析了正常组和CRC组之间的免疫微环境差异。正常组和CRC组之间的免疫细胞含量差异可以在图16A、B中直观地看到。使用统计的“wilcox.test”方法比较了两组之间的差异（图16C）。嗜酸性粒细胞、巨噬细胞M0、巨噬细胞M1、巨噬细胞M2、活化肥大细胞、静止肥大细胞、中性粒细胞、浆细胞、T细胞CD4记忆活化、T细胞CD4记忆静止、T细胞CD4初级、T细胞CD8、γδT细胞、调节性T细胞（Tregs）等在两组之间存在显著差异（p值<0.05）。其中，嗜酸性粒细胞、巨噬细胞M2、浆细胞、T细胞CD4记忆静止、T细胞CD8、γδT细胞、调节性T细胞（Tregs）是CRC组中最具侵袭性的免疫细胞。M1/M2比值失衡在恶性肿瘤的形成、免疫逃逸和随后的转移治疗抵抗中具有重要意义。图16D显示了关键基因与免疫细胞之间的关系，表明关键基因与巨噬细胞M0、巨噬细胞M1和活化肥大细胞之间存在强烈的正相关，而与浆细胞、CD8 T细胞、CD4记忆静止T细胞、γδ T细胞、巨噬细胞M2、静止肥大细胞和嗜酸性粒细胞之间存在强烈的负相关。

IL1B_1I1B的结果：小分子与受体之间的结合能为-6.2kcal/mol，表明它具有良好的相互作用力，并主要与GLY A49和LYS A103形成氢键结合，如图17A所示。GSK3B_1J1B的结果：小分子与受体之间的结合能为-7.5 kcal/mol，表明它具有良好的结合效果。小分子主要与ASN A152、GLNA151、ARGA107、ILEA28和LYS A103形成氢键与受体蛋白相互作用，如图17B所示。NOS3_3E7S的结果：小分子与受体之间的结合能为-7.0 kcal/mol，表明它具有良好的结合效果。小分子主要与GLUA284、ARGA106、TRPA370和TRPA279相互作用，并发现明显的氢键相互作用，如图17C所示。RELA_1NFI的结果：小分子与受体之间的结合能为-6.3 kcal/mol，表明它具有良好的结合效果。小分子主要通过形成氢键和疏水键力与受体蛋白相互作用，其中包括氢键THRA164、ASNA131和GLUE92，如图17D所示。CDK4_3G33的结果：小分子与受体的结合能为-6.4 kcal/mol，表明具有良好的结合效果。小分子与受体蛋白相互作用，包括GLUB74和GLUD175形成的氢键，如图17E所示。有关栀子苷和关键基因的对接得分请参见表2。

总结

根皮苷在分子对接结果中显示出与中心基因的高结合活性。作者发现五个中心基因的mRNA水平在CRC组织中显著表达，并且ILIB的预后价值显著不同（p值<0.05）。随着病理分期的演变（从I期到IV期），IL1B的mRNA表达逐渐减少，而NOS3的mRNA表达逐渐增加。以上分析结果基本与文献报道一致。